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實(shí)驗(yàn)室中檢測大腸桿菌

更新時間:2021-03-16      瀏覽次數(shù):6606

實(shí)驗(yàn)室中檢測大腸桿菌

 

一、調(diào)味品、醬腌制品中大腸菌群的測定

測定方法見“糕點(diǎn)、糖果中大腸菌群的測定”

二、

糕點(diǎn)、糖果中大腸菌群的測定

1、原理:大腸菌群是指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌注意來源于人畜糞便,故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量,具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。

食品中大腸菌群數(shù)是以每100ml(g)檢樣內(nèi)大腸菌群的zui可能數(shù)(The most probable number,簡稱MPN)表示。據(jù)此含義,所有食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的大腸菌群均應(yīng)以100ml(g)食品內(nèi)允許含有大腸菌群的實(shí)際數(shù)值為報告標(biāo)準(zhǔn)。檢查大腸菌群數(shù),一方面能表明食品中有無糞便污染,另一方面還可以根據(jù)數(shù)量的多少,判定食品受污染的程度。

2、培養(yǎng)基及試劑:乳糖發(fā)酵管,伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB),生理鹽水,革蘭氏染色液,單料乳糖膽鹽發(fā)酵管,雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管。

3、器具及其他用品:恒溫箱、廣口瓶或三角瓶、吸量管、載玻片、水浴鍋、天平、顯微鏡、玻璃珠:直徑為5mm、酒精燈、均質(zhì)器或乳缽、溫度計、平皿:直徑為90mm、試管、接種針、試管架

4、大腸菌群的檢驗(yàn)程序

5、檢樣稀釋

1)以無菌操作將檢樣25ml(g)放入含有225ml滅菌生理鹽水的滅菌三角瓶內(nèi)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振搖或研磨制成1:10均勻稀釋液。

2)用1ml滅菌吸量管吸取1:10稀釋液1ml,注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖試管使其混勻,制成1:100稀釋液。

3)另取1ml滅菌吸量管,按上述操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1ml滅菌吸量管。

4)根據(jù)糕點(diǎn)及糖果衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的要求或?qū)z樣污染情況的估計,選擇3個稀釋度,每個稀釋度接種3管。

6、發(fā)酵試驗(yàn)

選擇3個稀釋度分別接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi),接種量在1ml以上者,可用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管;1ml及1ml以下者,可用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每個稀釋度接種3管,置于(36±1)℃恒溫箱內(nèi),培養(yǎng)(24±2)h,若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報告為大腸菌群陰性;若有產(chǎn)氣者,則按下列程序進(jìn)行檢驗(yàn)。

7、分離培養(yǎng)

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,置于35~37℃恒溫箱內(nèi),培養(yǎng)18~24h,然后取出觀察菌落形態(tài),并做革蘭氏染色、鏡檢和乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。

8、復(fù)發(fā)酵證實(shí)試驗(yàn)

在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1~2個進(jìn)行革蘭氏染色,同時接種乳糖發(fā)酵管,置于(36±1)℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)(24±2)h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌,即可報告為大腸菌群陽性。

9、報告

根據(jù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù),查表可知。報告每100ml(g)大腸菌群的zui可能數(shù)。

10、注意事項(xiàng)

挑取菌落:大腸菌群是一群腸道桿菌的總稱,大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等復(fù)雜多樣,而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。在實(shí)際工作當(dāng)中,為了提高大腸菌群的檢出率,應(yīng)當(dāng)熟悉其菌落的形態(tài)和色澤。在檢驗(yàn)方法中我們選用伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基,在該平板上,大腸菌群菌落大多呈紫黑色有金屬光澤或無金屬光澤。菌落形態(tài)的其他方面(如菌落的大小、光滑與粗糙、邊緣完整情況、隆起情況、濕潤與干燥等)雖也應(yīng)注意,但不如色澤方法更為重要。挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率也有密切的關(guān)系。在實(shí)際工作中由于工作量大,通常只挑取一個菌落,但影響大腸菌群檢出率的因素很多,如食品種類、菌落色澤和形態(tài)、細(xì)菌種類等,只挑取一個菌落,由于幾率問題,很難避免假陰性的出現(xiàn),尤其當(dāng)菌落不典型時。所以,挑取菌落時一定要挑取典型菌落,若無典型菌落則應(yīng)多挑取幾個菌落,以免出現(xiàn)假陰性。

程序:大腸菌群的國標(biāo)檢驗(yàn)法采用三步法,即乳糖發(fā)酵、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。第-一步乳糖發(fā)酵試驗(yàn)是樣品的發(fā)酵結(jié)果,不是純菌的發(fā)酵試驗(yàn),所以初發(fā)酵陽性管,經(jīng)過后兩步,有可能成為陰性。大量檢驗(yàn)數(shù)據(jù)證明,食品中大腸菌群檢驗(yàn)程序的符合率、初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差很大,不同食品三步法俄符合情況也不一致。一般來說,如果平板上有較多典型大腸菌群菌落,革蘭氏染色為陰性桿菌,即可做出判定。如果平板上典型菌落較少或均不夠典型,則應(yīng)多挑菌落做證實(shí)試驗(yàn),以免出現(xiàn)假陰性。只做一步初發(fā)酵,對某些食品來說誤差較大。這樣做,會有相當(dāng)部分的合格樣品被作為不合格樣品處理,應(yīng)予以注意。

產(chǎn)氣量:在糖發(fā)酵試驗(yàn)中經(jīng)??梢钥吹剑诎l(fā)酵套管內(nèi)存在極微小的氣泡(有時比小米粒還要?。愃七@種情況能否算作產(chǎn)氣陽性,這是許多人經(jīng)常遇到的問題。大腸菌群的產(chǎn)氣量,多者可以使發(fā)酵套管充滿氣體,少者產(chǎn)生比米粒還小的氣泡。一般來說,產(chǎn)氣量與大腸菌群檢出率呈正比的關(guān)系,但隨樣品種類而有不同,有米粒大小的氣泡的也有陽性檢出,另外,對未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管是否均應(yīng)做陰性處理,根據(jù)大量實(shí)踐工作經(jīng)驗(yàn)來看,對這種情況應(yīng)慎重考慮,有時會遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸無氣,但復(fù)發(fā)酵卻證實(shí)為大腸菌群陽性。有時套管內(nèi)雖無氣體,但在液面及管壁可以看到緩緩上升的小氣泡。所以對未產(chǎn)氣的發(fā)酵管有疑問時,可用手輕輕敲動或搖動試管,若有氣泡沿管壁上浮,即考慮為有氣體產(chǎn)生,應(yīng)做進(jìn)一步試驗(yàn)觀察。這種情況的陽性檢出率可達(dá)半數(shù)以上。

MPN檢索表:MPN表示樣品中活菌密度的估測。MPN檢索表是采用3個稀釋度9管法,稀釋度的選擇是基于對樣品中菌數(shù)的估測,較理想的結(jié)果應(yīng)是zui低稀釋度3管為陽性,而zui高稀釋度3管為陰性。如果無法估測樣品中的菌數(shù),則應(yīng)做一定范圍的稀釋度。

在查閱MPN檢索表時,應(yīng)注意以下問題:在MPN檢索表第-一欄陽性管數(shù)下面列出的ml(g)是指原樣品(包括液體和固體)的量,并非稀釋后的量。對固體樣品更應(yīng)注意:如固體樣品1g經(jīng)10倍稀釋后,雖加入1ml量,但實(shí)際其中只含有0.1g樣品,故應(yīng)按0.1g計算。MPN檢索表中只提供三個稀釋度,即1ml(g)、0.1 ml(g)、0.01ml(g);若改用10ml(g)、1 ml(g)、0.1ml(g)時,則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。其余可類推。

 

三、

月餅中大腸菌群的測定(實(shí)訓(xùn))

1、儀器及試劑

1)儀器:恒溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計、直徑為90mm的平皿、試管、廣口瓶或三角瓶、吸量管、載玻片、接種針、直徑為5mm的玻璃珠、酒精燈、試管架

2)試劑:單料乳糖膽鹽發(fā)酵管、雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、EC肉湯、磷酸鹽緩沖溶液、生理鹽水、革蘭氏染色液

2、操作步驟

以無菌操作將25g月餅放于含有225ml滅菌生理鹽水的滅菌三角燒瓶內(nèi)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振搖或研磨制成1:10均勻稀釋液。用1ml滅菌吸量管吸取1:10稀釋液1ml,注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖試管使其混勻,制成1:100稀釋液。另取1ml滅菌吸量管,按上述操作順序做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1ml滅菌吸量管。根據(jù)月餅污染情況的估計,選擇3個稀釋度,每個稀釋度接種3管。選擇3個稀釋度分別接種于乳糖發(fā)酵管內(nèi),接種量在1ml以上者,可用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管;1ml或1ml以下者,可用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管,置于(36±1)℃恒溫箱內(nèi),培養(yǎng)(24±2)h,若所有乳糖發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報告為大腸菌群陰性;若有產(chǎn)氣者,則按下列程序進(jìn)行檢驗(yàn);將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,置于35~37℃恒溫箱內(nèi),培養(yǎng)18~24h,然后取出觀察菌落形態(tài),并做革蘭氏染色、鏡檢和乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1~2個進(jìn)行革蘭氏染色,同時接種乳糖發(fā)酵管,置于(36±1)℃恒溫箱內(nèi),培養(yǎng)(24±2)h,觀察產(chǎn)氣情況。

3、數(shù)據(jù)記錄及處理

1)將各步試驗(yàn)結(jié)果填入下表中

符號接種量/ml乳糖膽鹽發(fā)酵管發(fā)酵情況EMB平板上菌落的生長情況革蘭氏染色及鏡檢情況復(fù)發(fā)酵管發(fā)酵情況結(jié)論
       
       
       

2)根據(jù)上述結(jié)果查MPN檢索表,得出被檢樣品每100g中大腸菌群細(xì)菌的zui可能數(shù)。

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